Programa


I. Sesiones de metodologia.

  1. Introducción. El DNA recombinante.
    Terminología. Antecedentes y desarrollo historico. Bases de genética bacteriana y del proceso de clonado mlecular. Conceptos de clon, clonar, DNA recombinante. Esquema general del procedimiento de clonación.
  2. Enzimas en la tecnología del DNA recombinante.
    Endonucleasas de restricción. DNA y RNA ligasas. Fosfatasa alcalina. Polinucleótidoquinasa. DNA polimerasas. RNA polimerasas. Nucleasas. Creación de moléculas de DNA recombinante.
  3. Vectores de uso general para clonado.
    Introducción. Plásmidos: elementos genéticos y ejemplos. Fagémidos: uso y ejemplos. Vectores derivados del bacteriófago lambda: uso y ejemplos. Cósmidos. Vectores de gran capacidad: Cósmidos PACs, BACs y YACs, uso y ejemplos.
  4. Vectores de células eucariotas animales.
    Introducción de DNA en células eucariotas animales (transfección): métodos y marcadores de selección. Elementos genéticos de los vectores de células eucariotas. Vectores lanzadera: ejemplos. Vectores de expresión: ejemplos. Vectores derivados de virus (SV40, Retrovirus, papiloma bovino, Epstein-Barr, Vaccinia Baculovirus, Adenovirus): elementos genéticos, uso y ejemplos.
  5. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
    Análisis de la reacción: especificidad, fases, componentes, optimiación. Variantes de la reacción: PCR anidado, PCR inverso, PCR anclado, RT/PCR, PCR anclado de cDNA (RACE). Clonado de productos de PCR. Secuenciación por PCR. PCR cuantitativo. PCR en tiempo real.
  6. Mutagénesis.
    Dianas de endonucleasas de restricción. Inserción aleatoria de linkers. Mutagénesis al azar. Deleciones seriadas. Mutagénesis dirigida por oligonucleótidos. Mutagénesis por PCR: dirigida, deleciones, en vector.
  7. Análisis de la variación genómica y de la expresión genética diferencial.
    PCR con cebadores arbitrarios. Fingerprint de DNA. Hibridación diferencial Genotecas de sustracción. Fingerprint de RNA (differential Display).
  8. Proteinas recombinantes.
    Sistemas de producción de proteinas en células procariotas: sistemas inducibles. Expresión en eucariotas: levaduras, células de inescto (baculovirus), células de mamífero.
  9. Construcción y rastreo de genotecas.
    Genotecas de DNA genómico. Genotecas de cDNA. Genotecas de expresión.
  10. Análisis de la regulación de la expresión genética.
    Determinación del punto de inicio de la transcripción. Análisis de las regiones promotoras: medida de la actividad transcripcional usando genes de referencia. Análisis de las interacciones DNA-proteína: ensayos de retardo de la movilidad electroforética (EMSA), ensayos de protección frente a la digestión con DNAsa (DNAse footprinting), ensayos de interferencia con la metilación. Inmunoprecipitación de cromatina. Estrategias para purificar nuevos factores de transcripción.

II. Laboratorio: determinación de la estructura genómica de un fragmento de un gen.

El trabajo de laboratorio se desarrollará durante una semana (lunes a viernes) todas las tardes.

Clonado de un fragmento genómico y de cDNA de un gen conocido.

  • Retrotranscripción de RNA con hexámeros de secuencia aleatoria.
  • Amplificación por PCR de un fragmento de cDNA de un gen conocido.
  • Amplificación por PCR de un fragmento genómico de un gen conocido.
  • Electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR.
  • Extracción y purificación de los productos de PCR a partir del gel de agarosa.
  • Ligación de los productos de PCR purificados en un vector plásmido.
  • Transformación de células competentes y obtención de colonias recombinantes.
  • Análisis de los recombinantes en cultivos en crecimiento por PCR de células lisadas.
  • Preparación de cultivos "stock" congelados.

Preparación de DNA plasmídico a partir de colonias recombinantes. Minipreparaciones.

Digestión analítica del plásmido obtenido con endonucleasas de restricción.

Análisis y explicación de los resultados obtenidos.

Elaboración de un informe final individual de resultados y conclusiones.

 
 

 

 

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