PROGRAMA PRÁCTICO

Práctica I: PCR en el diagnóstivo virológico del virus del hepatitis C

1. Doble PCR anidado cualitativo del virus de la hepatitis C (VHC)

2. PCR cuantitativa (qPCR) en tiempo real del VHC

2.1 Cuantificación absoluta

2.2 Cuantificación relativa

3. Genotipado del VHC con PCR

Práctica II: Separación, análisis y cuantificación de polisacáridos, lípidos y proteínas/anticuerpos. Producción de anticuerpos; conceptos básicos acerca de los anticuerpos policlonales y monoclonales.

2.1. Separación cromatográfica de polisacáridos libres y unidos a lípidos/proteínas.

2.1.1. Purificación de polisacáridos mediante cromatografía de afinidad con lectinas. Análisis, en gel de SDS-PAGE, de las glicoproteínas purificadas; tinción con azul de Coomassie.

2.1.2. Cuantificación de hexosas totales mediante la reacción de la antrona.

2.2. Purificación, análisis y cuantificación de proteínas.

2.2.1. Producción de IgGs en cultivo in vitro desde hibridomas, precipitación con sulfato amónico, diálisis/filtración y cromatografía de afinidad con proteína A. Cuantificación por métodos espectrofotométricos directos. Análisis de la purificación mediante SDS-PAGE y tinción con azul de coomassie.

2.2.2. Purificación de IgGs totales del plasma mediante cromatografía de intercambio iónico. Análisis de la purificación.

2.2.3. Separación de lípidos y proteínas mediante reparto no desnaturalizante entre dos fases líquidas y cuantificación de proteínas mediante el método indirecto del ácido bicinconínico.

2.3. Separación, análisis y cuantificación de lípidos.

2.3.1. Extracción de lípidos totales.

2.3.2. Separación de fosfolípidos en cromatografía de adsorción en columna.

2.3.3. Análisis de la separación de fosfolípidos en cromatografía de capa fina.

2.3.4. Cuantificación de fosfolípidos.

2.4. Conocer los fundamentos de la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales.

 Práctica III: Métodos inmunológicos en la detección de proteínas

3.1. Análisis de la activación de proteínas por Western-blot:

3.1.1 Cultivo celular y cinética de tratamiento con IFN-alfa a tiempos cortos.

3.1.2 Lisis celular y preparación del extracto proteico.

3.1.3 Cuantificación de la concentración de proteína.

3.1.4 SDS-PAGE.

3.1.5 Tinción de geles de poliacrilamida con Azul de Coomasie.

3.1.6 Western Blot.

3.1.7 Inmunodetección de proteínas.

3.2. Cuantificación de proteínas por ELISA.

3.2.1 Cultivo celular y tratamiento con IFN-alfa a tiempos largos.

3.2.2 Determinación de los niveles de la proteína IP-10 por ELISA.